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檸檬酸合酶(CS)活性檢測試劑盒

CS（EC 2.3.3.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞的線粒體基質中，是三羧酸循環個限速酶，是三羧酸循環主要調控位點之一。 CS 催化乙酰 CoA 和草酰乙酸產生檸檬酰輔酶 A，進一步水解產生檸檬酸；該反應促使無色的 DTNB 轉變成黃色的 TNB，在 412nm 處有特征吸光值。

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組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離： ① 稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細胞，加入 1mL 提取液和 10μL 試劑一，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。 ② 將勻漿液 600g，4℃離心 5min。 ③ 將上清液移另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。 ④ 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的 CS。 ⑤ 在沉淀中加入 200μL 試劑一和 2μL 試劑二，反復吹打充分混勻，用于 CS 測定。 ⑥ 檸檬酸合酶酶活即沉淀和上清液中的酶活之和。

1、組織中 CS 活力的計算: （1）按樣本蛋白濃度計算：單位的定義：37℃或 25℃下每 mg 組織蛋白在反應體系中每分鐘催化產生 1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位。 CS 上清（U/mg prot）=ΔA 上清÷ε÷d×V 反總÷（Cpr 上清×V 樣本）÷T=1050×ΔA 上清÷Cpr 上清 CS 沉淀（U/mg prot）=ΔA 沉淀÷ε÷d×V 反總÷（Cpr 沉淀×V 樣本）÷T =1050×ΔA 沉淀÷Cpr 沉淀 CS（U/mg prot）=CS 上清+CS 沉淀=1050×ΔA 上清÷Cpr 上清+1050×ΔA 沉淀÷Cpr 沉淀。（2）按樣本鮮重計算：單位的定義：37℃或 25℃下每 g 組織在反應體系中每分鐘催化產生 1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位。 CS 上清（U/g 鮮重）=ΔA 上清÷ε÷d×V 反總÷（W×V 樣本÷V 提?。?divide;T =1050×ΔA 上清÷W CS 沉淀（U/g 鮮重）=ΔA 沉淀÷ε÷d×V 反總÷（W×V 樣本÷V 沉淀）÷T =212×ΔA 沉淀÷W CS（U/g 鮮重）=CS 上清+CS 沉淀=1050×ΔA 上清÷W+212×ΔA 上清÷W。 2、細菌或培養細胞中 CS 活力的計算: （1）按樣本蛋白濃度計算：單位的定義：37℃或 25℃下每 mg 蛋白在反應體系中每分鐘催化產生 1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位。 CS 上清（U/mg prot）=ΔA 上清÷ε÷d×V 反總÷（Cpr 上清×V 樣本）÷T=1050×ΔA 上清÷Cpr 上清 CS 沉淀（U/mg prot）=ΔA 沉淀÷ε÷d×V 反總÷（Cpr 沉淀×V 樣本）÷T=1050×ΔA 沉淀÷Cpr 沉淀 CS（U/mg prot）=CS 上清+CS 沉淀=1050×ΔA 上清÷Cpr 上清+1050×ΔA 沉淀÷Cpr 沉淀。（2）按細菌或細胞密度計算：單位的定義：37℃或 25℃下每 1 萬個細菌或細胞在反應體系中每分鐘催化產生 1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位。 CS 上清（U/104 cell）=ΔA 上清÷ε÷d×V 反總÷（500×V 樣本÷V 提?。?divide;T=2.1×ΔA 上清 CS 沉淀（U/104 cell）=ΔA 沉淀÷ε÷d×V 反總÷（500×V 樣本÷V 沉淀）÷T =0.42×ΔA 沉淀 CS（U/104 cell）=CS 上清+CS 沉淀=2.1×ΔA 上清+0.42×ΔA 沉淀。第 3 頁 共 3 頁 ε：TNB 的消光系數，13.6×10-3mL/(nmol·cm)；V 反總：反應體系總體積，0.2 mL；d：比色皿光徑，1cm；V 樣本：加入的樣本體積，0.007mL；V 提取：提取液體積，1mL；V 沉淀：溶解沉淀的總體積，0.202mL；T：反應時間，2min；Cpr 上清：上清液的蛋白濃度，mg/mL；Cpr 沉淀：沉淀溶解后的蛋白濃度, mg/mL；W：樣本鮮重，g。