文獻背景
中性粒細胞作為體內必需的先天免疫細胞，在癌癥監測中發揮著關鍵作用。中性粒細胞彈性蛋白酶(ELANE)可以準確識別并快速消除突變的腫瘤細胞。ELANE及其同源的豬胰腺彈性蛋白酶(PPE)不僅具有與ELANE相似的蛋白質結構和初級底物特異性，而且具有切割C末端CD95結構域的能力。釋放的CD95蛋白的死亡結構域與癌細胞中高表達的組蛋白H1相互作用，誘導腫瘤細胞凋亡。PPE和ELANE對抑制劑的敏感性不同，PPE對絲氨酸蛋白酶抑制的敏感性較低。此外，PPE不僅比ELANE更容易獲得，而且對皮下腫瘤的治療效果更顯著，副作用更低。
由于PPE在體內的活性有限，將其轉化為有效的抗腫瘤藥物仍然面臨著巨大的挑戰。首先，PPE在細胞水平上切割CD95蛋白的效率很低，導致藥理作用不足。其次，體內給藥后，PPE活性容易被高濃度的絲氨酸蛋白酶抑制劑抑制，包括血漿α2-巨球蛋白和α1-抗胰蛋白酶，但其在體內腫瘤組織中的定位還不夠精確。許多蛋白質的生物學功能可以通過一些特殊金屬離子等輔助因子進行精確調控。這些輔助因子可以通過底物結合和酶催化來激活或抑制蛋白質的活性。例如，鐵離子可以促進血紅素蛋白對氧的轉移和運輸。作者提出了一種基于金屬輔因子的策略，可用于保護和增強切割目標蛋白質時彈性蛋白酶的活性，并開發了一種裂解活性增強的彈性蛋白酶納米復合物(CAEN)，以Mn2+作為輔助因子，形成Ca2+的生物礦化外殼。以PPE為模型藥物，少量Mn2+與其活性中心結合，提高了切割效率，保護PPE免受絲氨酸蛋白酶的抑制。生物礦化外殼保護了PPE的活性不被激活，增強了對腫瘤細胞的藥物輸送。通過非侵入性霧化吸入給藥方式治療肺癌，實現器官特異性給藥。癌細胞內的酸性環境促進了納米外殼的溶解，進一步釋放了含有鈣和錳的PPE蛋白。在細胞水平上，與游離PPE相比，含Mn2+的PPE對CD95蛋白具有更高的切割效率和更強的誘導凋亡作用。在體內，CAEN可以有效地遞送到腫瘤細胞中，且該系統中的金屬離子能夠有效激活肺癌組織的局部免疫系統，產生協同抗腫瘤作用。
基本信息
題目：An elastase nanocomplex with metal cofactors for enhancement of target
protein cleavage activity and synergistic antitumor effect
期刊：Chemical Engineering Journal
影響因子：15.1
DOI：10.1016/j.cej.2024.149902
通訊作者：林志強 梁令 李天成
作者單位：
北京大學基礎醫學院
首都醫科大學附屬北京朝陽醫院
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摘要
ELANE通過裂解靶蛋白，在識別和破壞各種癌細胞方面發揮著至關重要的作用。然而，由于其蛋白質裂解效率不足、缺乏腫瘤組織靶向性以及對絲氨酸蛋白酶抑制的敏感性使ELANE的體內治療效果受到限制。本研究采用基于金屬輔因子的方法增強靶蛋白裂解和抗腫瘤作用，使用PPE為模型藥物，在體外開發并優化了一種具有增強切割活性的CAEN。通過吸入給藥，CAEN防止了PPE在生物環境中的降解，并有效地將其輸送到腫瘤細胞。與游離的PPE相比，CAEN能以更高的特異性有效裂解CD95，從而誘導肺癌細胞顯著凋亡。此外，釋放的金屬離子可以激活巨噬細胞中的I型干擾素，進一步增強肺癌組織內的局部免疫反應。
研究內容及結果
1.CAEN可以保護和穩定PPE蛋白的活性
通過生物礦化過程制備了切割活性增強型CAEN（圖1）。圖2A顯示了孵育時間和金屬離子含量對CAEN形成的影響。透射電子顯微鏡結果（圖2B）顯示納米顆粒通常是均勻的、球形的，PPE和CAEN的平均尺寸分別為10.26±0.87 nm和148.79±6.00 nm（圖2C）。如圖2D，PPE和CAEN的電位結果分別為負電位和正電位。蛋白質表面富含羧基，PPE在中性溶液中表面帶負電荷，電位的變化指示了生物礦化外殼的有效形成。能量色散X-射線光譜分析結果證實CAEN由Ca、Mn、P、C、O和N組成（圖2E）。圖2G中的紅外光譜結果顯示了納米顆粒的組成。納米顆粒含有Ca、Mn、P、N和O，Mn2+離子的價態主要為二價（圖2F）。如圖2H-K，納米顆粒對PPE蛋白的活性具有保護作用。
圖1
2.CAEN可以特異性切割CD95促進腫瘤細胞凋亡
在由H57、D102、S195和S214組成的PPE的活性中心周圍，Mn2+而不是Ca2+與D60和D97相互作用（圖3A，B）。此外，Mn2+與PPE蛋白能夠相互結合。將Mn2+和PPE的蛋白質復合體結構與PPE和小分子抑制劑的蛋白質復合體結構進行比較（圖3C），Mn2+改變了PPE蛋白的結構，與蛋白質印跡實驗中白蛋白對非特異性條帶的阻斷作用相似。為了驗證不同制備組對CD95的切割能力，純化MBP-CD95蛋白并對其進行切割實驗（圖3E-G）。MBP-CD95(200-335)的理論分子量為58.3kD（圖3D）。將不同的制劑組與MBP-CD95蛋白孵育30min（圖3E）。CAEN組和PPE蛋白組均能有效地切割MBP-CD95，但PPE組切割MBP-CD95，而CAEN組僅選擇性切割CD95蛋白。為了測試CAEN在腫瘤細胞內切割CD95的能力，進行了不同劑型(PBS、PPE、NP或CAEN)處理MDA-MB-231細胞和A549細胞的蛋白質印跡實驗。CAEN治療組較其他對照組有較深的條帶，證實了CAEN有效切割CD95蛋白的能力（圖S14）。CAEN治療組腫瘤細胞發生凋亡的比例最為顯著（圖3F,G），表明CAEN具有誘導細胞凋亡的能力。與PBS和PPE組相比，CAEN組與腫瘤細胞孵育6h后細胞內活性氧(ROS)水平顯著升高，CAEN組大鼠心肌細胞線粒體膜電位明顯降低，細胞內線粒體功能受損（圖3H）。在蛋白質水平上進一步測定了不同處理組B16-F10細胞的凋亡指數（圖3I）。
圖2
3.CAEN可提高輸送效率和肺滯留時間
將B16-F10與CAEN-FITC共孵育4h后，綠色熒光彌散在腫瘤細胞的胞漿中，表明CAEN能有效和快速地被腫瘤細胞吸收（圖4A）。為驗證氣霧劑的成功給藥，使用考馬斯亮藍溶液(CBB)作為指示劑證明藥物可以有效地進入小鼠的肺組織。小鼠肺組織中有大量CBB溶液，主要分布在氣管和支氣管（圖4B）。使用肺霧化噴霧給小鼠注射該藥物來研究CAEN的保留情況（圖4C）。使用Cy7熒光染料標記的PPE進行肺噴霧給藥，熒光成像結果顯示CAEN-Cy7處理的肺組織中熒光分布更強、更深，表明礦化納米顆粒作為載體具有良好的穿透和保留能力（圖4D、E）。
圖3
圖S14
圖4
4. CAEN體內釋放對腫瘤生長的抑制作用
為驗證CAEN的抗腫瘤作用，將B16-F10細胞經尾靜脈注入C57BL/6小鼠，形成局部抗腫瘤治療的肺癌模型（圖5A）。分別于第5、13、21天解剖小鼠，收集肺組織。隨后，計數小鼠肺組織中的轉移灶。如圖5B、C所示，CAEN組在抗腫瘤治療期間保持了良好的療效，沒有明顯的轉移。在治療期間，小鼠的體重沒有顯著變化（圖5D）。心、肝、脾、肺和腎等主要器官的染色結果表明，CAEN并未引起這些器官明顯的病理變化（圖5E）。腫瘤組織HE染色顯示，CAEN組小鼠組織切片中癌細胞較少，而PBS組和PPE組腫瘤細胞數量較多（圖5F）。對健康小鼠進行相同處理后，發現PPE治療組對健康小鼠肺組織造成炎性損傷，CAEN治療組和PBS治療組無明顯變化（圖5G）。如圖5H-K所示，TUNEL染色證實CAEN有效地誘導了細胞凋亡，且CAEN組CD8+T細胞比例在所有治療組中最高。免疫組織化學染色結果顯示，CAEN能顯著減少腫瘤組織中Ki67+細胞的數量，有效抑制了腫瘤細胞的增殖（圖S19）。
5. CAEN具有良好的生物安全性
CAEN對心、肝、腎功能無明顯影響（圖6A-C）。相比之下，PPE組各項指標均升高，且有一定毒性。血液學分析顯示，包括PBS、PPE或CAEN在內的不同治療組小鼠的紅細胞(RBC)、白細胞(WBC)和血小板(PLT)水平保持在正常范圍內（見圖6D-F）。
圖5
圖S19
結論
PPE作為一種新型的抗腫瘤蛋白藥物，具有很強的誘導腫瘤細胞凋亡的能力。本研究設計并制備了一種含有Ca2+、PPE及其輔因子(Mn2+)的切割活性增強型彈性酶納米復合體(CAEN)，來實現對CD95蛋白的特異性切割。CAEN不僅能有效保護和穩定PPE蛋白的活性，而且對不同類型的癌細胞具有有效的殺傷作用。此外，基于鈣離子的生物礦化策略可以有效地提高細胞內攝取，對控制和預防PPE引起的肺組織蛋白酶相關的平衡失調起到積極的作用。CAEN中金屬離子的釋放影響了腫瘤細胞的內環境，導致腫瘤細胞內活性氧水平升高和線粒體損傷。結合Mn2+的免疫激活功能，具有良好生物安全性的CAEN在體內外均能有效抑制癌細胞的生長。總之，本研究為蛋白質藥物在抗腫瘤治療中的應用提供了一種有效的研究思路。
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